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第 5 筆
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論文名稱: | Aeromonas salmonicida MAEF108 之 Agarase AS-IIIb基因及 Pseudomonas vesicularis MA103 之 AgarasePV-Ib 基因轉殖至乳酸菌及生產含藻類寡醣發酵乳製品之探討
| Studies on Cloning of Agarase Genes of AS-IIIb from Aeromonas salmonicida MAEF108 and PV-Ib fromPseudomonas vesicularis MA103 in Lactic Acid Bacteria and Production of Lactic Fermented Product with Algal Oligosaccharides
研究生: | 廖友豪 You-Hao Liao
指導教授: | 潘崇良 Chorng-Liang Pan
學位類別: | 碩士
學校名稱: | 國立臺灣海洋大學
系所名稱: | 食品科學系
學號: | M96320067
畢業學年度: | 97
語文別: | 中文
關鍵字: | 洋菜酶 Agarase
| 乳酸菌 Lactic acid bacteria
| 基因轉殖 gene cloning
| 發酵乳製品 fermented product
全文影像連結: | | (本論文20120730對校內公開)
| 論文全文(pdf)

論文頁數: | 117
摘要: | 本研究之目的在於探討 Agarase 基因 AS-IIIb 及 PV-Ib 利用穿梭
| 載體對乳酸菌進行轉殖，並以乳酸菌發酵含青海菜寡醣之脫脂牛乳
| ，且探討青海菜寡醣對發酵產物之抗氧化、抗凝血活性、美白活性的影
| 響。乳酸菌 Ped. pentosaceus MFS、MFL、Lb. bulgaricus BCRC 10696、Lb. plantarum BCRC 10069 以 mutanolysin 處理後之原生質體(Protoplast) 形成效率，分別為 46.3%、3.4%、5.6%、及 9.9%。原生質體經 2.0 kV 電穿孔處理後還有 7.3 log CFU/mL以上之菌體存活。
| 轉殖之部分以 RF-clonimg 技術分別將pDG148-Stu 和 pVA838 載體對
| Agarase AS-IIIb 與 PV-1b 基因進行構築，但未成功獲得 Agarase 基因
| 重組菌株。後續將載體 pDG148-Stu 以限制酶 Stu、T4 polymerase 及
| dTTP 反應處理，也尚未獲得到轉殖株。青海菜寡醣 (Monostroma nitidum oligosaccharides, MnOS) 區分為分子質量 (A) 3-5 kDa 區分液含 (Degree of polymerization, DP) DP 6、12、和 30，且有最高之還原醣量及硫酸根含量 (0.28 mg/mL 和 0.68 mg/mg) 與 (B) 1-3 kDa 區分液含 DP 6。含 0.1%、0.05%、和 0.02% MnOS 脫脂牛乳發酵後，結果顯示 Lb. Plantarum BCRC 10069 (2%) + 12250 (2%) 發酵 16 小時後 pH 值可降至 4.6 以下，可滴定酸度 0.67-0.68%、乳酸菌數達 9 log CFU/mL 以上，Ped. pentosaceus MFL + MFS 則發酵 24 小時後達 pH 4.6 以下，可滴定酸度 0.60-0.70，乳酸菌數達 8.5 log CFU/mL 以上。發酵乳製 MnOS-GAI-0.1% 有最好之 DPPH 清除力 21.73%，而 MnOS-GBII- 0.1% 有最高之螯合亞鐵離子能力為 72.56%。4oC 儲藏試驗部分，於 14 天後，pH 值隨時間增加持續下至 4.47-4.07，而可滴定酸度則會上升至 0.76%-0.89%，抗氧化能力隨儲藏時間增加而降低。抗凝血活性部分，牛乳發酵產物 MnOS-GAI-100 g/mL 於兔血 APTT 結果與控制組相比，凝血時間延後 20 秒，凝血程度也降低了 32.4%，而 PT 的部分，可降低凝血程度 2.7%，於人血 APTT 與 PT 測試之結果，則降低了 8.7% 及 7.5% 之凝血程度。取抗氧化效果較好之發酵樣品進行細胞試
| 驗及美白測試之結果，皆有使老鼠纖維母細胞 NIH-3T3 及人類纖維母
| 細胞 CCD-966SK 增長之效果，細胞存活率可達 124-128% 及 122-
| 138%。於酪胺酸酶活性抑制測試中抑制力隨濃度提高而增加，抑制能力
| 為 35-37%，而後對人類黑色素腫瘤細胞 A375 測試，有抑制細胞生長
| 之效果，最低存活率為 46-87%。實驗結果雖無法成功獲得洋菜酶重組
| 乳酸菌株，但原生質體之處理及電穿孔條件可做為相關實驗之參考，而
| 添加青海菜之牛乳發酵產物具有做為健康食品及美白成分之潛力。
|
| The object of this study was clone the Agarase gene AS-IIIb and
| PV-Ib into the lactic acid bacteria (LAB) with shuttle vector. And
| investigate LAB ferment Monostroma nitidum oligosaccharides (MnOS)
| contained milk on the effect of MnOS of their antioxidant
| properties, anticoagulant properties, and whitening properties.  The results
| showed that the effectively of protoplast formation of Ped. pentosaceus
| MFS, MFL, Lb. bulgaricus BCRC 10696, and Lb. plantarum BCRC 10069
| treated with mutanolysin were 46.3%, 3.4%, 5.6%, and 9.9% respectively.
| There was more than 7.3 log CFU/mL LAB kept alive after the protoplast
| electroporated by 2.0 kV voltage.  The constructions of Agarase AS-IIb and
| PV-IB genes and vectors pVA838 and pDG148-Stu by restriction-free (RF)
| cloning were not completed. The constructed gene of pDG148-Stu vector
| were treated with restricted enzyme Stu, T4 polymerase, and dTTP but the
| clone was not observed yet.  MnOS was separated by ultrafiltration to
| obtain (A) 3-5 kDa fraction contained degree of polymerization (DP) 6, 12,
| and 30 with the highest reducing sugar content and sulftate content (0.28
| mg/mL and 0.68 mg/mg) and (B) 1-3 kDa fraction contained DP 6.  In the
| fermented experiment of 0.10%, 0.05%, and 0.02% MnOS contained milks,
| Lb. plantarum BCRC 10069 + 12250 group took 16 hr to reached the pH
| < 4.6, titratable acidity were 0.67-0.68%, and LAB counts were above 9 log
| CFU/mL. Ped. pentosaceus MFL + MFS group took 24 hr to reached the pH
| < pH 4.6, titratable acidity were 0.60-0.70%, and LAB counts were above
| 8.5 log CFU/mL.  The MnOS-GAI-0.1% cultured milk had the best
| scavenging DPPH free radicals ability 21.73% and MnOS-GBII-0.1% had
| the best chelating Fe2+ ability 72.56%.  The pH value of two MnOS cultured
| milks were fell to 4.47-4.07, and titratable acidity were increased to
| 0.76%-0.89% during 4oC for 14 days. The abilities of antioxidation were
| decreased as storage time increased.  The APTT anticoagulants activity test
| of rabbit plasma showed the MnOS-GAI-100 g/mL group compared with
| control which could delay the coagulant time for 20 sec, and decrease the
| coagulation effect for 32.4%. The rabbit plasma PT anticoagulants activity test result showed it could decrease the coagulation effect for 2.7%, and on human plasma it decreased 8.7% and 7.5% coagulation effect for APTT and PT.  The MnOS cultured milks with better antioxidative ability could
| increase the cell viability of NIH-3T3 and CCD-966SK of 124-128% and 122-138%.  The inhibition of tyrosinase was increased with increasing the concentration of MnOS cultured milk, and the inhibition were 35-37%. The MnOS cultured milks could inhibited the A375 cell, and the cell viability were 46-87%.  The experiment results did not obtain the recombined clone, but the result of protoplast formation and electroporation conditions could be consulted. The MnOS cultured milk had the potential to be developed as
| health food product and used as whitening ingredient in cosmetic product.
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論文目次: | 目錄      i
| 表目錄      vii
| 圖目錄      viii
| 附錄目錄      xi
| 中文摘要      xii
| 英文摘要 (Abstract)      xiv
| 壹、前言      1
| 貳、文獻整理      3
| 一、 洋菜的構造與特性      3
| 二、 洋菜酶      3
| 三、 洋菜酶生產菌株及其分離來源      4
| 四、 洋菜酶之生化特性      4
| 4-1. 溫度和 pH 值      4
| 4-2. 分子質量      5
| 4-3. 金屬離子      6
| 五、 洋菜酶基因的選殖      7
| 5-1. 大腸桿菌做為宿主之轉殖系統      7
| 5-2. 酵母菌做為宿主之轉殖系統      8
| 5-3. 無限制酶剪切為基因選殖 (restriction-free cloning)      8
| 5-4. pVA838 穿梭載體 (shuttle vector) 的利用      9
| 六、 藻類多醣      9
| 6-1. 青海菜      9
| 七、 藻類寡醣生理活性      10
| 7-1. 免疫性      10
| 7-2. 降低血脂      11
| 7-3. 益菌性      11
| 7-4. 抗氧化活性      11
| 7-5. 抗凝血活性      12
| 7-6. 抗病毒活性      12
| 八、 海藻寡醣組成成分鑑定      13
| 8-1. 薄層層析法 (thin-layer chromatography, TLC)      13
| 8-2. 高效能液相層析法 (high-performance liquid
| chromatography, HPLC)      14
| 8-3. 核磁共振光譜法 (nuclear magnetic resonance, NMR)      14
| 8-4. 傅立葉轉換紅外線光譜儀 [fourier-transform infrared
| (FTIR) spectroscopy]      15
| 九、 乳酸菌      16
| 9-1. 乳酸菌定義      16
| 9-2. 益生菌      17
| 9-3. 乳酸菌之生理活性      17
| 十、 凝血機制      19
| 10-1. 內在途徑 (intrinsic pathway)      20
| 10-2. 外在途徑 (extrinsic pathway)      21
| 10-3. 凝血作用的測試      21
| 十一、 皮膚與黑色素      22
| 11-1. 黑色素      22
| 11-2. 酪胺酸酶      22
| 11-3. 與酪胺酸競爭酪胺酸酶的物質      23
| 參、實驗設計      24
| 肆、實驗材料與方法      25
| 一、實驗材料
| 1-1. 實驗菌株      25
| 1-2. 實驗藥品      25
| 1-2-1. 藥品      25
| 1-2-2. 載體      28
| 1-2-3. 引子      28
| 1-2-4. 聚合酶鏈鎖反應試劑      28
| 1-2-5. 限制酶及蛋白酶抑制劑      28
| 1-2-6. DNA 及蛋白質萃取純化套裝試劑      28
| 1-2-7. 電泳標準品      29
| 1-2-8. 培養基組成    30
| 1-2-9. 洋菜酶反應基質      31
| 1-2-10. DNS 溶液      31
| 1-2-11. 電泳膠片配製      31
| 1-2-12. 無菌過濾      32
| 1-3. 儀器設備      32
| 二、實驗方法      34
| 2-1. 菌種保存與活化      34
| 2-1-1. 菌株保存      34
| 2-1-2. 菌株活化      34
| 2-2. Agarase AS-IIIb 基因以大腸桿菌系統進行選殖      35
| 2-2-1.  重組載體 DNA 之萃取純化      35
| 2-2-2. 無限制酶剪切位基因選殖 [restriction-free
| (RF) cloning] 引子設計      35
| 2-2-3.  pDG148-Stu 載體轉殖      36
| 2-2-4. E. coli 勝任細胞 (competent cell) 製作      37
| 2-2-5. E. coli轉化作用 (transformation)      38
| 2-2-6. 利用 PCR 確認插入之基因片段大小      39
| 2-2-7. DNA 序列比對      39
|
| 2-3. Agarase AS-IIIb及 PV-1b 基因以乳酸菌系統進行
| 選殖      39
| 2-3-1. 乳酸菌原生質體製程      39
| 2-3-2. 乳酸菌原生質體再生      40
| 2-3-3. 電穿孔轉形      40
| 2-3-4.  酵素活性測定      40
| 2-3-5.  洋菜酶活性單位定義      40
| 2-4. 海藻寡醣發酵產品之製備      41
| 2-4-1.  菌株之保存      41
| 2-4-2.  菌株之活化      41
| 2-4-3.  含海藻寡醣發酵乳製品的製備      41
| 2-4-4.  總醣量測定      42
| 2-4-5.  還原醣量測定      42
| 2-4-6.  硫酸根含量測定      43
| 2-4-7.  pH 值之測定      43
| 2-4-8.  可滴定酸度之測定      44
| 2-4-9.  乳酸菌菌數測定      44
| 2-4-10. 儲藏試驗      44
| 2-5. 寡醣成分分析      44
| 2-5-1.  HPLC 鑑定      44
| 2-5-2.  FT-IR 鑑定      45
| 2-6. 抗氧化活性測定      45
| 2-6-1.  螯合鐵離子能力測定      45
| 2-6-2.  清除 DPPH 自由基能力測定      45
| 2-7. 抗凝血活性測定      46
| 2-7-1.  凝血酶原時間 (prothrombin time, PT)      46
| 2-7-2.  活化部份凝血活酶時間 (activited partial
| thromboplastin time, APTT)      46
| 2-8. 細胞實驗評估抗老化功效      47
| 2-8-1.  細胞培養      47
| 2-8-2.  細胞繼代培養      47
| 2-8-3.  細胞存活 [3-(4,5-cimethylthiazol-2-yl)-2,5-
| diphenyl tetrazolium bromide, MTT]      47
| 2-9. 美白功能試驗      47
| 2-9-1.  抑制酪胺酸酶活性測定      47
| 2-9-2.  對人類黑色素腫瘤細胞 A375 存活率的影響      48
| 伍、結果與討論      49
| 1. 轉殖用乳酸菌原生質體形成效率及電穿孔條件      49
| 2. Agarase 之基因轉殖      50
| 3. 乳酸菌發酵含青海菜寡醣乳製品      51
| 4. 含青海菜寡醣發酵乳製品抗氧化活性      52
| 4-1. 清除 DPPH 自由基之能力      52
| 4-2. 螯合亞鐵離子之能力      52
| 5. 含青海菜寡醣發酵乳製品之處藏試驗      53
| 5-1. pH 值、可滴定酸度與乳酸菌量之變化      53
| 5-2. 抗氧化能力之變化      54
| 6. 含青海菜寡醣發酵乳製品之抗凝血能力      54
| 7. 含青海菜寡醣發酵乳製品之細胞實驗評估抗老化功效      56
| 7-1. 對老鼠胚胎纖維母細胞 NIH 3T3 存活率及增生      56
| 7-2. 對人類纖維母細胞 CCD-966SK 存活率及增生      57
| 8. 含青海菜寡醣發酵乳製品之美白功能試驗      58
| 8-1. 抑制酪胺酸酶活性測試      58
| 8-2. 對人類黑色素腫瘤細胞 A375 存活率之影響      58
|
| 陸、結論      60
| 柒、參考文獻      61
| 實驗結果表      76
| 實驗結果圖      86
| 捌、附錄      108
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| 表目錄
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| 表1、  乳酸菌原生質體製備及形成效率      76
| 表2、  Agarase pET 21b 重組載體 (aga 1、aga 2、aga b) 以不同
| 電壓進行電穿孔對不同乳酸菌株影響比較      77
| 表3、  實驗所用寡核苷酸引子組      78
| 表4、  青海菜經不同前處理之全醣量、還原醣量及硫酸根含量
| 測定      79
| 表5、  以Lb. plantarum BCRC 12250 及 10069 發酵含
| 青海菜寡醣乳製品之 pH 值、可滴定酸度、與微生
| 物菌數變化      80
| 表6、  以 Ped. pentosaceus MFL 及 MFS 發酵含青海菜寡醣
| 乳製品之pH值、可滴定酸度、與微生物菌數變化      81
| 表7、  以乳酸菌 Lb. plantarum BCRC 10069 和 12250
| 發酵添加不同濃度青海菜寡醣之乳製品對 DPPH 自由
| 基之清除效應      82
| 表8、  以乳酸菌 Ped. pentosaceus MFL 和 MFS 發酵添加
| 不同濃度青海菜寡醣之乳製品對 DPPH 自由基之清
| 除效應      83
| 表9、  以乳酸菌 Lb. plantarum BCRC 10069 和 12250
| 發酵添加不同濃度青海菜寡醣乳製品對螯合亞鐵能力之
| 測定      84
| 表10、　以乳酸菌 Ped. pentosaceus MFL 和 MFS 發酵添加不同
| 海菜寡醣之乳製品對螯合亞鐵能力之測定      85
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| 圖目錄
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| 圖1、    載體 pDG 148–Stu 及 Agarase AS-IIIb 基因之 RF cloning
| 實驗過程中各階段 PCR 產物其 1% 洋菜糖膠電泳分析      86
| 圖2、  A. salmonicida MAEF108 之 Agarases AS-IIIb 基因之
| 核苷酸序列及 E. coli DH5重組菌株 T23 之insert 基
| 因核苷酸序列比對      87
| 圖3、  載體 pDG 148–Stu 及 Agarase AS-IIIb-1, 2 與 Agarase
| PV-Ib 基因經限制酶 Stu 與 T4 DNA polymerase 進行轉
| 殖之實驗過程中各階段產物其 1% 洋菜糖膠電泳分析      88
| 圖4、  pVA838 載體及 Agarase PV-1b 基因之 RF cloning 實驗
| 過程中各階段之 PCR 產物其 1% 洋菜膠糖電泳分析      89
| 圖5、  5% 青海菜 (M. nitidum) 熱萃液經 MAEF108及 MA103-
| agarase降解後之分子質量區分寡醣HPLC分析圖譜:
| (A) 熱萃液經 3 kDa 超過濾膜 (MWCO) 處理; (B) 熱萃
| 液經3 kDa 及 5 kDa 超過濾膜處理      90
| 圖6、  5% 青海菜 (M. nitidum) 熱萃液經 MAEF108 及 MA103-
| agarase降解後之分子質量區分寡醣 FTIR 分析圖譜:
| (A) 熱萃液經 3 kDa超過濾膜 (MWCO)處理; (B) 熱萃液
| 經3 kDa 及 5 kDa 超過濾膜處理      91
| 圖7、  以 Lb. plantarum BCRC 12250 和 10069 發酵含青海菜
| 寡醣乳製品之 MnOS-GAI-0.1% 於 4oC 儲藏 14 天之
| pH、可滴定酸度、與乳酸菌數變化      92
| 圖8、  以 Ped. pentosaceus MFS 及 MFL 發酵含青海菜寡醣乳
| 製品之 MnOS- GBII-0.1% 於 4oC 儲藏 14 天之 pH、
| 可滴定酸度、與乳酸菌數變化      93
|
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| 圖9、  以 Lb. plantarum BCRC 12250 和 10069 發酵含青海菜
| 寡醣乳製品之 MnOS-GAI-0.1% 於 4oC 儲藏 14
| 天之清除 DPPH 自由基與螯合亞鐵離子能力      94
| 圖10、    以 Ped. pentosaceus MFS 及 MFL 發酵含青海菜寡醣乳
| 製品之 MnOS- GBII-0.1% 於 4oC 儲藏 14 天之清除
| DPPH 自由基與螯合亞鐵離子能力      95
| 圖11、    添加不同濃度青海菜寡醣之乳製品經由乳酸菌 Lb.
| plantarum BCRC 12256 及 10069 發酵後，對兔血漿進行
| 其活化部分凝血活酶時間之測量      96
| 圖12、    添加不同濃度青海菜寡醣之乳製品經由乳酸菌 Lb.
| plantarum BCRC 12256 及 10069 發酵後，對兔血漿進行
| 其凝血酶原時間之測量      97
| 圖13、    添加不同濃度青海菜寡醣之乳製品經由乳酸菌 Ped.
| pentosaceus MFS 及 MFL 發酵後，對兔血漿進行其活化部
| 分凝血活酶時間之測量      98
| 圖14、    添加不同濃度青海菜寡醣之乳製品經由乳酸菌 Ped.
| pentosaceus MFS 及 MFL 發酵後，對兔血漿進行其凝血酶
| 原時間之測量      99
| 圖15、    添加不同濃度青海菜寡醣之乳製品經由乳酸菌 Lb.
| plantarum BCRC 12256 及 10069 發酵後，對人血漿進行
| 其活化部分凝血活酶時間之測量      100
| 圖16、    添加不同濃度青海菜寡醣之乳製品經由乳酸菌 Lb.
| plantarum BCRC 12256 及 10069 發酵後，對人血漿進行
| 其凝血酶原時間之測量      101
| 圖17、      添加不同濃度青海菜寡醣之乳製品經由乳酸菌 Ped.
| pentosaceus MFS 及 MFL 發酵後，對人血漿進行其活化部
| 分凝血活酶時間之測量      102
| 圖18、        添加不同濃度青海菜寡醣之乳製品經由乳酸菌 Ped.
| pentosaceus MFS 及 MFL 發酵後，對人血漿進行其凝血酶
| 原時間之測量      103
| 圖19、        添加青海菜寡醣牛乳發酵產物 (A) MnOS-GA 及 (B) MnOS-
| GB 對老鼠胚胎纖維母細胞 NIH 3T3 培養 48 小時後之
| 生長的影響      104
| 圖20、        添加青海菜寡醣牛乳發酵產物 (A) MnOS-GA 及 (B) MnOS-
| GB 對人類皮膚纖維母細胞 CCD-966SK 培養 48 小時後
| 之生長的影響      105
| 圖21、        青海菜寡醣牛乳發酵產物 (A) MnOS-GA 及 (B) MnOS-
| GB 對酪胺酸酶活性抑制比率      106
| 圖22、        添加青海菜寡醣牛乳發酵產物 (A) MnOS-GA 及 (B) MnOS-
| GB 對人類皮膚黑色素癌細胞 A 375 培養 48 小時後之
| 生長的影響      107
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| 附錄目錄
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| 附錄1、  Agarose 的基本構造及洋菜酶作用位置      108
| 附錄2、  Agaropectin可能組成基本單位構造      109
| 附錄3、  洋菜酶的生化特性      110
| 附錄4、  凝血機制圖      111
| 附錄5、  pVA838 載體限制酶切位圖譜      112
| 附錄6、  pDG148-Stu 載體限制酶切位圖譜      113
| 附錄7、  pDG148-Stu 載體轉殖流程圖      114
| 附錄8、  常見化學鍵振動頻率及強度      115
|
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2010 年 3 月 8 日 22:52