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第 8 筆
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論文名稱: | 耳突麒麟菜寡醣混合物之抗氧化活性及美白功能研究
| Antioxidative and Whitening Activities of Oligosaccharides Derived from Eucheuma cottonii
研究生: | 王瓊誼 Chiung-Yi Wang
指導教授: | 潘崇良 Chorng-Liang Pan
學位類別: | 碩士
學校名稱: | 國立臺灣海洋大學
系所名稱: | 食品科學系
學號: | T96420018
畢業學年度: | 97
語文別: | 中文
關鍵字: | 抗氧化 Antioxidative
| 美白 Whitening
| 寡醣 Oligosaccharides
| 耳突麒麟菜 Eucheuma cottonii
| 保濕 Moisturizing
全文影像連結: | | (本論文20120729對校內公開)
| 論文全文(pdf)

論文頁數: | 103
摘要: | 本研究探討以酵素水解所得耳突麒麟菜 (Eucheuma cottonii) 熱萃多醣液之寡醣區分物，在抗氧化、抗老化、美白、及保濕等方面之生理功效。耳突麒麟菜以 121oC 和 40 min 熱萃所得多醣液，經 5 unit/mL Cellulase (37oC, pH 5.0) 及 5 unit/mL Crude agarases (40oC, pH 6.2 與 6.0) 二組酵素反應所得寡醣水解液之還原醣量最高，再以超過濾膜劃分出八組不同分子質量耳突麒麟菜寡醣 (Eucheuma cottonii oligosaccharides, EUOS) 區分物，測定抗氧化活性。結果顯示，DPPH自由基清除能力及亞鐵離子螯合能力以 3-5 kDa Crude agarases-EUOS 之測試結果 53.15 ± 0.13%  (相當於 96.09 ± 0.23 ppm Ascorbic acid) 及 85.22 ± 0.23% (相當於 165.71 ± 0.44 ppm Ascorbic acid) 最好；還原能力測定，寡醣水解物之分子質量越大，還原力越高；總酚含量測定，以 > 5 kDa Crude agarases-EUOS 最高，相當於 104.74 ± 3.21 ppm Gallic acid；其次為 3-5 kDa Crude agarases-EUOS，相當於 84.37 ± 1.28 ppm Gallic acid。選定抗氧化活性較好之 3-5 kDa 及 > 5 kDa Crude agarases-EUOS，進行抗老化、美白功能及保濕實驗。抗老化細胞實驗中，分子質量 3-5 kDa EUOS 對於老鼠胚胎纖維母細胞 NIH 3T3 增生較好；培養 48 hr 對於 NIH 3T3 細胞存活率有增加的作用。3-5 kDa 及 > 5 kDa EUOS，在濃度 125 μg/mL 以上，細胞存活率較高，對於人類皮膚纖維母細胞 CCD-966SK 有增生趨勢。美白功能試驗顯示，對於體外酪胺酸酶活性抑制率以 > 5 kDa EUOS 較好，當濃度 20 mg/mL 時抑制率達 84.83 ± 3.33%，在細胞實驗中 > 5 kDa 及 3-5 kDa EUOS 培養 24 hr 對黑色素腫瘤細胞 A375 無增生作用，培養 48 hr 後，以 > 5 kDa EUOS 在低濃度抑制細胞生長效果較 3-5 kDa 好。皮膚保濕試驗結果顯示，塗抹 > 5 kDa EUOS 後，可增加正常皮膚含水率為約 4.17%；在以 20% SDS 誘發之乾性皮膚角質層含水率， > 5 kDa EUOS可增加約 4.34%，接近甘油效果 (增加 4.83%)。皮膚平滑度測定︰正常皮膚與誘發乾性皮膚之皮膚平滑度測定結果皆是以塗抹 > 5 kDa EUOS 後效果最好，但試驗組間的數據並未呈現明顯差異性。綜合上述耳突麒麟菜寡醣混合物具開發做為抗氧化、美白及保濕功能之化粧品原料深具潛力。
| This study is to explore the efficacy of antioxidative, anti-aging, whitening, and moisturizing of the oligosaccharides produced from Eucheuma cottonii polysaccharides extract digested by enzymes. Polysaccharides of Eucheuma cottonii was extracted by hot water at 121oC for 40 min and then digested by 5 unit/mL cellulase (37°C, pH 5.0) or 5 unit/mL crude agarases (40°C, pH 6.2 and 6.0) obtaining two groups of  Eucheuma cottonii oligosaccharide (EUOS) of the highest reducing suger content. These EUOS were then subject to ultrafiltration for separation by molecular weight cut-off membrane into eight different groups for determining antioxidant activity. The best results showed the scavenging effect on DPPH free radical and the ability of chelating on Fe2+ ion for 3-5 kDa crude agarases-EUOS were 53.15 ± 0.13% and 85.22 ± 0.23%, which are equivalent to 96.09 ± 0.23 ppm ascorbic acid and 165.71 ± 0.44 ppm ascorbic acid, respectively. In terms of reducing power test, it was found that the greater the molecular weight of EUOS, the higher the reducing power. Total phenolic content for > 5 kDa crude agarases-EUOS is equivalent to the performance of 104.74 ± 3.21 ppm gallic acid was the highest in the tested EUOS. Followed by the 3-5 kDa crude agarases-EUOS, which showed that it’s total phenolic content equal to 84.37 ± 1.28 ppm gallic acid. Based on the antioxidant activity performaned 3-5 kDa and > 5 kDa crude agarases-EUOS were selected for anti-aging, whitening, and moisturizing capacities experiments. In the anti-aging cell experiments, 3-5 kDa EUOS used for mouse embryonic fibroblast NIH 3T3 cell proliferation performed better than > 5 kDa EUOS. In addition, 48 hr culturing of NIH 3T3 cells with 3-5 kDa EUOS increased cell survival counts. EUOS 3-5 kDa and > 5 kDa fractions which used in the concentrations of 125 μg/mL or more, led to a higher survival rate for human skin fibroblast CCD-966SK terd to be hyperplasia. Whitening function tests showed that the in vitro tyrosinase inhibition rate of > 5 kDa EUOS was better than that of 3-5 kDa EUOS. When the concentration of EUOS was at 20 mg/mL, the inhibition rate for tyrosinase activity was 84.83 ± 3.33%. For melanoma cell growth inhibition experiments, EUOS > 5 kDa and 3-5 kDa fractions were applied to cultured melanoma cells A375. Over a 24 hr incubation period, there was no proliferation of cells in the culture. Which incubated to 48 hr, it was observed that > 5 kDa EUOS fraction at low concentrations was more effective in inhibiting melanoma cell growth than 3-5 kDa EUOS did. With regards to moisturizing capacity, > 5 kDa EUOS present a high water content of normal skin than control by 4.17%, which was better than 3-5 kDa EUOS had. In 20% SDS-induced dry skin stratum corneum, water content of the > 5 kDa EUOS group was increased to about 4.34%, close to the effect of glycerin (an increase of 4.83%). For skin smoothness, > 5 kDa EUOS showed the best results in terms of improving dry skin and normal skin. However, the results of these experiments showed no obvious improvement over those for the control group. It is evident from this study that derived oligosaccharides from Eucheuma cottonii are useful in antioxidative, whitening, and moisturizing shin and show good potential to be raw material for cosmetics.
論文目次: | 目錄    I
| 表目錄    vi
| 圖目錄    vii
| 附錄目錄    x
| 中文摘要    xi
| 英文摘要 (Abstract)    xiii
| 壹、前言    01
| 貳、文獻整理    03
| 1. 藻類的簡介    03
| 2. 麒麟菜介紹    04
| 2-1. 型態和分佈    04
| 2-2. 成份    05
| 2-3. 利用價值    05
| 3. 藻類多醣介紹    06
| 3-1. 藻類多醣之定義與特性    06
| 3-2. 藻類多醣之萃取方法    07
| 3-3. 藻類多醣之應用    08
| 3-4. 藻類多醣之生理活性    08
| 4. 洋菜酶對藻類水解的作用機制    09
| 5. 洋菜酶水解藻類多醣之產物    09
| 5-1. 生理活性    10
| 5-1-1. 免疫性…    10
| 5-1-2. 降低血脂    11
| 5-1-3. 抗致突變性    11
| 5-1-4. 益菌性    11
| 5-1-5. 抗氧化性    13
| 5-1-6. 抗病毒性    13
| 5-1-7. 抗凝血性    14
| 5-2. 應用    15
| 6. 麒麟菜寡醣混合物成分鑑定    17
| 6-1. 薄層色層分析法 (Thin-layer chromatography, TLC)    17
| 6-2. 高效能液相層析法 (High-performance liquid chromato-
| graphy, HPLC)    18
| 7. 麒麟菜寡醣混合物抗氧化活性    19
| 7-1. 酵素水解與抗氧化性    19
| 7-1-1. 酵素水解對植物抗氧化活性成分的影響…    19
| 7-1-2. 市售酵素的選擇…    19
| 7-2. 抗氧化測定原理    20
| 7-2-1.    α,α-Diphenyl-β-picrylhydrazyl (DPPH) 自由基清
| 除能力指標    20
| 7-2-2. 亞鐵離子螯合能力測定指標    20
| 7-2-3. 還原力測定指標    21
| 7-2-4. 總酚含量測定指標    21
| 8. 皮膚之簡介    21
| 8-1. 皮膚的構造    21
| 8-2. 皮膚與老化    22
| 8-3. 皮膚與黑色素    23
| 8-3-1. 黑色素…    23
| 8-3-2. 酪胺酸酶…    23
| 8-3-3. 與酪胺酸競爭酪胺酸酶的物質…    24
| 8-4. 皮膚與紫外線    24
| 8-4-1. 紫外線…    24
| 8-4-2. 紫外線對皮膚老化的影響…    25
| 8-5. 皮膚與保濕作用    26
| 8-5-1. 保濕劑    26
| 參、實驗設計    27
| 肆、材料與方法    28
| 1. 實驗材料    28
| 1-1. 藻類原料    28
| 1-2. 實驗菌株    28
| 1-3. 實驗細胞株    28
| 1-4. 試驗藥品    28
| 1-4-1. 藥品    28
| 1-4-2. 培養基    31
| 1-4-3.    DNS溶液      31
| 1-5. 材料與儀器設備    31
| 2. 實驗方法    33
| 2-1. 麒麟菜之一般成分分析    33
| 2-1-1. 水分含量    33
| 2-1-2. 粗灰分含量    33
| 2-1-3. 粗蛋白含量    33
| 2-1-4. 粗脂肪含量    33
| 2-2. 全醣量測定    34
| 2-3. 硫酸根含量測定    34
| 2-4. 菌株之保存與活化    35
| 2-4-1. 產洋菜酶海洋菌株之保存    35
| 2-4-2. 產洋菜酶海洋菌株之活化    35
| 2-5. Agarase 粗酵素液之生產    35
| 2-6. 洋菜酶活性測定    37
| 2-6-1. 洋菜酶反應基質配置方法    37
| 2-6-2. 測定方法    37
| 2-6-3. 洋菜酶活性單位定義    37
| 2-7. 麒麟菜熱萃多醣液之製備    38
| 2-8. 麒麟菜寡醣混合物生產及分析    38
| 2-8-1. 麒麟菜寡醣水解液的生產    38
| 2-8-2. 還原醣量之測定    38
| 2-8-3. 麒麟菜寡醣混合物生產    39
| 2-8-4.    HPLC 高效能液相層析法    39
| 2-9. 麒麟菜寡醣混合物抗氧化性    39
| 2-9-1.    α,α-Diphenyl-β-picrylhydrazyl (DPPH) 自由基
| 清除能力測定    39
| 2-9-2. 亞鐵離子螯合能力測定    39
| 2-9-3. 還原力測定    40
| 2-9-4. 總酚含量測定    40
| 2-10. 細胞實驗評估抗老化功效    40
| 2-10-1. 細胞培養    40
| 2-10-2. 細胞繼代培養    41
| 2-10-3. 細胞存活率 (MTT assay)    41
| 2-10-4. 對老鼠胚胎纖維母細胞 NIH 3T3 增生作用    41
| 2-10-5. 對人類皮膚纖維母細胞 CCD-966SK 增生作用    42
| 2-11. 美白功能試驗    42
| 2-11-1. 抑制酪胺酸酶活性測定    42
| 2-11-2. 對人類黑色素細胞 A375 存活率的影響    43
| 2-12. 皮膚保濕試驗    43
| 2-12-1. 受測之條件    43
| 2-12-2. 對正常及誘發乾性皮膚角質層含水率及皮膚
| 平滑度的測定    43
| 2-13. 統計與分析    44
| 伍、結果與討論    45
| 1. 耳突麒麟菜一般成分分析    45
| 2. 以五種多醣分解酵素降解耳突麒麟菜熱萃多醣液    45
| 3. 不同分子質量耳突麒麟菜寡醣混合物之產率    46
| 4. 耳突麒麟菜寡醣混合物抗氧化性    47
| 4-1.    α,α-Diphenyl-β-picrylhydrazyl (DPPH) 自由基清除
| 能力測定    48
| 4-2. 亞鐵離子螯合能力測定    49
| 4-3. 還原力測定    50
| 4-4. 總酚含量測定    50
| 5. 以高效能液相層析法分析耳突麒麟菜寡醣混合物    51
| 6. 細胞實驗評估抗老化功效    52
| 6-1. 對老鼠胚胎纖維母細胞 NIH 3T3 存活率及增生作用    52
| 6-2. 對人類皮膚纖維母細胞 CCD-966SK 存活率及增生作用    53
| 7. 美白功能試驗    54
| 7-1. 抑制酪胺酸酶活性測定    54
| 7-2. 對人類黑色素腫瘤細胞 A375 存活率的影響    54
| 8. 皮膚保濕試驗    55
| 8-1. 對正常或誘發乾性皮膚角質層含水率的測定    55
| 8-2. 對正常或誘發乾性皮膚平滑度的測定    56
| 陸、結論    59
| 柒、參考文獻    60
| 捌、附錄    100
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| 表目錄
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| 表 1、    耳突麒麟菜之一般成分分析    72
| 表 2、    以 粗 Agarases 酵素液、α-Amylase、Cellulase、β-Galacto-
| sidase 或 Xylanase (5 unit/mL) 在其最適條件下降解耳突
| 麒麟菜熱萃多醣液 (1%, w/v) 時反應液中全醣含量之變化    73
| 表 3、  以 粗 Agarases 酵素液、α-Amylase、Cellulase、β- Galacto-
| sidase、或 Xylanase (5 unit/mL) 在其最適條件下降解耳突
| 麒麟菜熱萃多醣液 (1%, w/v) 時反應液中還原醣含量之變化    74
| 表 4、  耳突麒麟菜熱萃多醣液 (1%, w/v) 經粗 Agarases 酵素液
| 水解 12 hr 後再以超過濾系統區分為不同分子質量區間
| 水解物的個別產率    75
| 表 5、  耳突麒麟菜熱萃多醣液 (1%, w/v) 經 Cellulase 水解24 hr
| 後再以超過濾系統區分為不同分子質量區間水解物的個別
| 產率    76
| 表 6、  耳突麒麟菜 (Euch.) 熱萃多醣液 (1%, w/v) 及經粗 Agarases
| 酵素液水解 12 hr 後再以超過濾系統區分為不同分子質量
| 區間水解物 DPPH 自由基之清除能力      77
| 表 7、    耳突麒麟菜 (Euch.) 熱萃多醣液 (1%, w/v) 及經 Cellulase
| 水解 24 hr 後再以超過濾系統區分為不同分子質量區間
| 水解物 DPPH 自由基之清除能力    78
| 表 8、    耳突麒麟菜 (Euch.) 熱萃多醣液 (1%, w/v) 及經粗 Agarases
| 酵素液水解 12 hr 後再以超過濾系統區分為不同分子質量
| 區間水解物對螯合亞鐵離子能力之測定    79
| 表 9、    耳突麒麟菜 (Euch.) 熱萃多醣液 (1%, w/v) 及經 Cellulase
| 水解 24 hr 後再以超過濾系統區分為不同分子質量區間
| 水解物對螯合亞鐵離子能力之測定    80
| 表10、    耳突麒麟菜 (Euch.) 熱萃多醣液 (1%, w/v) 及經粗 Agarases
| 酵素液水解 12 hr 後再以超過濾系統區分為不同分子質量
| 區間水解物對還原能力之測定    81
| 表 11、    耳突麒麟菜 (Euch.) 熱萃多醣液 (1%, w/v) 及經 Cellulase
| 水解 24 hr 後再以超過濾系統區分為不同分子質量區間
| 水解物對還原能力之測定    82
| 表 12、    耳突麒麟菜 (Euch.) 熱萃多醣液 (1%, w/v) 及經粗 Agarases
| 酵素液水解 12 hr 後再以超過濾系統區分為不同分子質量
| 區間水解物之總酚含量    83
| 表 13、 耳突麒麟菜 (Euch.) 熱萃多醣液 (1%, w/v) 及經 Cellulase
| 水解 24 hr 後再以超過濾系統區分為不同分子質量區間
| 水解物之總酚含量    84
| 表 14、 10% 耳突麒麟菜寡醣混合物塗於人體正常或誘發乾性皮對
| 角質層含水率之影響    85
| 表 15、 10% 耳突麒麟菜寡醣混合物塗於人體正常或誘發乾性皮對
| 角質層平滑度之影響    86
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| 圖目錄
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| 圖 1、    以粗 Agarases 酵素液水解耳突麒麟菜熱萃多醣液 (1%, w/
| v) 12 hr 後以超過濾系統區分為 3-5 kDa 分子質量水解物
| 之高效能液相層析圖    87
| 圖 2、    以粗 Agarases 酵素液水解耳突麒麟菜熱萃多醣液 (1%, w/
| v) 12 hr後以超過濾系統區分為 > 5 kDa 分子質量水解物
| 之高效能液相層析圖    88
| 圖 3、    以不同濃度之麒麟菜寡醣 > 5 kDa 及 3-5 kDa 之分子質量
| 混合物培養 24 hr，對老鼠胚胎纖維母細胞 NIH 3T3成長
| 的影響    89
| 圖 4、    以不同濃度之麒麟菜寡醣 > 5 kDa 及 3-5 kDa 之分子質量
| 混合物培養 48 hr，對老鼠胚胎纖維母細胞 NIH 3T3成長
| 的影響    90
| 圖 5、    以不同濃度之麒麟菜寡醣 > 5 kDa 及 3-5 kDa 之分子質量
| 混合物培養 24 hr，對人類皮膚纖維母細胞 CCD-966SK
| 成長的影響    91
| 圖 6、    以不同濃度之麒麟菜寡醣 > 5 kDa 及 3-5 kDa 之分子質量
| 混合物培養 48 hr，對人類皮膚纖維母細胞 CCD-966SK
| 成長的影響    92
| 圖 7、    以不同濃度之麒麟菜寡醣 > 5 kDa 及 3-5 kDa 之分子質量
| 混合物或 維生素 C 對酪胺酸酶活性抑制率    93
| 圖 8、    以不同濃度之麒麟菜寡醣 > 5 kDa 及 3-5 kDa 之分子
| 質量混合物培養 24 hr，對於人類皮膚黑色素瘤細胞 A375
| 成長的影響    94
| 圖 9、    以不同濃度之麒麟菜寡醣 > 5 kDa 及 3-5 kDa 之分子
| 質量混合物培養 48 hr，對於人類皮膚黑色素瘤細胞 A375
| 成長的影響    95
| 圖 10、    10% 耳突麒麟菜寡醣混合物 (EUOS) 塗於人體正常皮膚
| 對角質層含水率之影響    96
| 圖 11、    10% 耳突麒麟菜寡醣混合物 (EUOS) 塗於人體誘發乾性
| 皮膚，對角質層含水率之影響    97
| 圖 12、    10% 耳突麒麟菜寡醣混合物 (EUOS) 塗於人體正常皮膚
| 對皮膚平滑度之影響    98
| 圖 13、    10% 耳突麒麟菜寡醣混合物 (EUOS) 塗於人體誘發乾性
| 皮膚對皮膚平滑度之影響    99
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| 附錄目錄
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| 附錄 1、 10 % 耳突麒麟菜寡醣混合物塗於手臂上測試的位置    100
| 附錄 2、 以粗 Agarases 酵素液、α-Amylase、Cellulase、β-Galacto-
| sidase、或 Xylanase (5 unit/mL) 在其最適條件下降解
| 耳突麒麟菜熱萃多醣液 (1%, w/v) 時反應液中全醣含量
| 之變化    101
| 附錄 3、 以粗 Agarases 酵素液、α-Amylase、Cellulase、β-Galacto-
| sidase、或 Xylanase (5 unit/mL) 在其最適條件下降解
| 耳突麒麟菜熱萃多醣液 (1%, w/v) 時反應液中還原醣含量
| 之變化    102
| 附錄 4、    半乳糖、乳糖、及木糖之高效能液相層析圖    103
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2010 年 3 月 8 日 22:55