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第 7 筆
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論文名稱: | 菟絲子屬植物乙醇萃取物抑制肝癌細胞與抗發炎活性之探討
| Study on Anticancer and Anti-Inflammatory Activities of Herbal Ethanol Extracts from Cuscuta spp.
研究生: | 魏培萱 Pei-Hsuan Wei
指導教授: | 潘崇良 Chorng-Liang Pan
學位類別: | 碩士
學校名稱: | 國立臺灣海洋大學
系所名稱: | 食品科學系
學號: | T98420007
畢業學年度: | 99
語文別: | 中文
關鍵字: | 菟絲子屬 Cuscuta spp.
| 人類肝癌細胞株 human hepatoma cells
| 小鼠巨噬細胞株 mouse macrophage RAW264.7 cells
| 總黃酮 total flavonoids
| 基原鑑定 Base of the original identification
全文影像連結: | | (本論文20140728開放校外瀏覽)
| 論文全文(pdf)

論文頁數: | 103
摘要: | 本研究主要探討菟絲子屬 (Cuscuta spp.) 植物寄生於不同寄主對人類肝癌細胞株 HepG2 及 Huh7 產生的細胞毒性，以及對脂多醣 (Lipopolysaccharide, LPS) 刺激小鼠巨噬細胞株 RAW 264.7 誘導表現一氧化氮合成酶 (Inducible nitric oxide synthase, iNOS) 的免疫活化作用，並以核糖體基因之內轉錄間隔區 (Internal transcribed spacer, ITS ) 序列進行基原鑑定探討其分群狀況，再以金絲桃苷 (Hyperoside) 為標準品利用高效能液相層析儀 (High performance liquid chromatography, HPLC) 分析比對樣品中的金絲桃苷成分，及測定所有菟絲子樣品中總黃酮含量以探討其與人類肝癌細胞株 HepG2 與 Huh7 及小鼠巨噬細胞株 RAW 264.7 的實驗結果關聯性。從台灣各處收集的 24 個菟絲子屬植物樣本，經 ITS DNA 序列分析得到正確學名，其中有 2 個樣品為日本菟絲子 (Cuscuta japonica)，2 個樣品為南方菟絲子 (Cuscuta australis)，其他 20 個樣品與平原菟絲子 (Cuscuta campestris) 相近。24 個菟絲子屬植物乙醇萃取物對 Huh7 細胞抑制生長結果，除市售的南方菟絲子種子 (編號5) 及寄生於構樹 (Broussonetia papyrifera) 之日本菟絲子全草 (編號18) 無呈現抑制細胞生長效果外，其他與控制組相比皆有顯著抑制效果 (p ＜ 0.05)，24 個菟絲子屬植物乙醇萃取物對 HepG2 細胞抑制生長結果發現，除寄生於山黃麻 (Trema orientalis) 之日本菟絲子全草 (編號19) 無呈現抑制細胞生長效果外，其他與控制組相比皆有顯著抑制結果 (p ＜ 0.05)，又以寄生於雞屎藤 (Paederia foetida) 的菟絲子屬植物 (編號10) 乙醇萃取物抑制細胞生長效果最明顯，其對於人類肝癌細胞株 HepG2 的 IC50 為41.62 μg/mL，以及對人類肝癌細胞株 Huh7的 IC50 為33.75 μg/mL。在 24 個菟絲子屬植物之乙醇萃取物對脂多醣 (Lipopolysaccharide, LPS) 刺激小鼠巨噬細胞株 RAW 264.7 誘導產生iNOS的評估實驗中，小鼠巨噬細胞株 RAW 264.7被 LPS 刺激誘導 24 小時後，培養液中的 Nitrite 生成量明顯增加，但經由市售的南方菟絲子種子 (編號5) 及全草 (編號12) 之乙醇萃取物加入培養 24小時後與控制組相比能明顯降低一氧化氮 (Nitric oxide, NO) 生成量 (p ＜ 0.05)；另外寄生在蔓性灌木蔓荊子 (Vitex rotundifolia) (編號24)、馬鞍藤 (Ipomoea pes-caprae ssp. brasiliensis) (編號22)、掃帚菊 (Aster subulatus) (編號23) 及多年生草本植物野牽牛 (Ipomoea cairic) (編號11) 的菟絲子屬植物乙醇萃取物與僅添加 LPS 的控制組相比皆能明顯降低 NO 生成量 (p ＜ 0.05)。24 個菟絲子屬植物乙醇萃取物添加於LPS 刺激的小鼠巨噬細胞株 RAW 264.7 中共同培養，小鼠巨噬細胞株 RAW264.7細胞存活率約在65-100%，與對照組相比無顯著性差異 (p ＞ 0.05)。在 HPLC 分析部分，除寄生於構樹和山黃麻的日本菟絲子 (編號18、19) 外，其他樣品與金絲桃苷對照品在相同的滯留時間都有吸收波峰產生，而總黃酮量最高的 3 個樣品分別是寄主為大花咸豐草 (編號 13)、馬鞍藤 (編號22) 及 蔓荊子 (編號24) 之樣品，含量依序為 42.72 mg/g、59.96 mg/g 及 37.94 mg/g ，且對人類肝癌細胞株 HepG2 與 Huh7 的細胞生長抑制效果及降低由 LPS 刺激小鼠巨噬細胞株誘導 NO 生成的能力與控制組相比有顯著差異 (p ＞ 0.05)，但其他總黃酮含量相對較低的樣品，對人類肝癌細胞株 HepG2 與 Huh7 生長抑制效果及降低由 LPS 刺激小鼠巨噬細胞株誘導 NO 生成的能力與對照組相比也有顯著差異 (p ＞ 0.05)，惟必須再進行後續實驗方能確認。
| This study aims to investigate the efficacy of extracts of Cuscuta spp. parasitizing on different hosts on human hepatoma HepG2 and Huh7, and LPS (Lipopolysaccharide)-stimulated mouse macrophage RAW264.7 cell lines. The authenticity of Cuscuta species was identified through comparison of sequences from the internal transcribed spacers of rDNA. The chemical profiles of extracts were illucidated by high pressure liquid chromatography where hyperin was used as the standard reference. Moreover, the total flavonoids of extracts were measured, and the relationship between total flavonoids and efficacy on cell lines HepG2, Huh7, and RAW 264.7 was also evaluated. The Cuscuta plant samples were collected from different areas of Taiwan and identified. Samples 18 and 19 belong to Cuscuta japonica, 05 and 12 are Cuscuta australis, while the other 20 samples are characterized as Cuscuta campestris. The ethanol extracts of Cuscuta spp. except Cuscuta australis seed (No. 5) that purchased from market and the whole plant of Cuscuta japonica (No. 18) parasitizing in Broussonetia papyrifera significantly decreased cell survival rate of the Huh7 cell line (p < 0.05). In HepG2 cell toxicity test, only the whole plant Cuscuta japonica (No. 19) parasitiizing in Trema orientalis showed no toxic effects, whereas the other extracts decreased the HepG2 cell growth significantly (p < 0.05). The most potent extract is the whole plant of Cuscuta spp. (No. 10) parasitizing in Paederia foetida. The IC50 for HepG2 and Huh7 is 41.62 μg/mL and IC50 of 33.75 μg/mL, respectively. The effect of ethanol plant extracts from 24 Cuscuta spp. on the RAW 264.7 cell line was examined after 24 hours LPS stimulation and NO production was measured by the nitrite formation in medium. Seed (No. 5) and whole plant of Cuscuta australis (No. 12), as well as the extracts of Cuscuta spp. parasitizing in Vitex rotundifolia (No. 24), Ipomoea pes-caprae ssp. Brasiliensis (No. 22), Aster subulatus (No. 23),  and Ipomoea cairic (No. 11) significantly decreased NO production (p <0.05) without obvious toxicity (cell survival rate ranged from 65-100%). In the HPLC analysis, the standard reference hyperin could be detected in most of the extracts except samples parasitizing in Broussonetia papyrifera and Trema orientalis (No. 18, 19).  Higher total flavonoids were detected 42.72 mg/g, 59.96 mg/g, and 37.94 mg/g in Cuscuta spp. parasitizing in Bidens pilosa var. radiata (No. 13), Ipomoea pes-caprae ssp. brasiliensis (No. 22) and Vitex rotundifolia (No. 24), respectively. And these ethanol extracts also showed inhibition on growth of HepG2 and Huh7 cell lines. Although further investigation will be required to clarify the relationship between the total extracted flavonoids and pharmaceutical efficacy to these cell lines and reduction of NO production on RAW 264.7 cell.
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論文目次: | 目錄    i
| 表目錄    v
| 圖目錄    vii
| 附錄目錄    ix
| 中文摘要    x
| 英文摘要 (Abstract)      xii
| 壹、前言    1
| 貳、文獻整理    3
| 一、    菟絲子簡介    3
| 1. 菟絲子藥材概述    3
| 2. 菟絲子植株介紹    4
| 3. 菟絲子的寄主種類    4
| 4. 不同寄主菟絲子的化學成分研究    4
| 5. 菟絲子藥理活性研究    5
| 5-1. 神經細胞保護    5
| 5-2. 保肝作用    5
| 5-3. 抑制皮膚癌增生    6
| 二、    DNA 條碼 (Barcode)      7
| 1. 同名之誤用或混用    7
| 2. 型態類似之誤用或混用    7
| 3. 偽用或代用    7
| 三、肝癌      8
| 四、    發炎      10
| 五、細胞毒性      11
| 參、實驗設計    12
| 肆、實驗材料與方法    13
| 一、實驗材料    13
| 1. 菟絲子全草    13
| 2. 實驗細胞株    13
| 2-1.    抗肝癌測試細胞株    13
| 2-2.    抗發炎測試細胞株    13
| 3. 實驗藥品    13
| 3-1.    基原鑑定 (中藥材ITS序列鑑定)    13
| 3-1-1. DNA 萃取    13
| 3-1-2.    聚合酶連鎖反應    14
| 3-1-3. DNA 電泳分析    14
| 3-2.    細胞培養    15
| 3-3.    細胞毒性試驗    15
| 3-4.    一氧化氮代謝產物Nitrite 的含量測定    15
| 3-5.    RP-HPLC分析    15
| 3-6.    總黃酮含量測定    16
| 4. 實驗器材    16
| 4-1.    基原鑑定 (中藥材ITS序列鑑定)    16
| 4-2.    細胞培養    17
| 4-3.    HPLC分析    18
| 4-4.    總黃酮含量測定    18
| 二、實驗方法    18
| 1. 試驗材料前處理    18
| 2. 基原鑑定 (中藥材ITS序列鑑定)    18
| 2-1.    DNA萃取及定量    19
| 2-1-1. DNA 萃取    19
| 2-1-2.    植物基因組 DNA 濃度測定    20
| 2-2.    PCR (Polymerase chain reaction) 反應之試驗    20
| 2-3.    洋菜糖膠電泳分析    21
| 2-4.    DNA 定序    22
| 2-5.    序列分析    22
| 3. 細胞培養    22
| 3-1.    樣品儲存    22
| 3-2.    樣品製備    22
| 3-3.    培養基配製    23
| 3-4.    PBS (Phosphate-buffered saline) 配製    23
| 3-5.    人類肝癌細胞株 (HepG2、Hep3B) 培養條件
| 及實驗方法    23
| 3-5-1. 繼代培養 (Subculture)    23
| 3-5-2. 保存    24
| 3-5-3. 細胞存活率試驗 (MTT assay)    24
| 3-5-4. 存活率公式    25
| 3-5-5.    細胞生長半抑制濃度 (Half inhibitory concentration, IC50, μg/mL) 計算    25
| 3-6. 小鼠巨噬細胞株 (RAW264.7) 培養條件及
| 實驗方法    25
| 3-6-1.    菟絲子屬植物乙醇萃取物抗發炎篩選    25
| 3-6-2.    NO生成量測定    26
| 3-6-3. 細胞存活率分析 (alamarBlue)    26
| 3-6-4. 統計方法    26
| 4. 高效能液相層析儀 (High performance liquid chromatography, HPLC) 分析    27
| 4-1. 菟絲子前處理    27
| 4-2. 菟絲子屬植物乙醇萃取物HPLC 圖譜分析    27
| 5. 總黃酮含量測定    27
| 5-1. 標準曲線之製備    27
| 5-2. 標準品精密度試驗    28
| 5-3. 樣品總黃酮含量測定    28
| 5-4. 樣品總黃酮穩定性試驗    28
| 5-5. 樣品總黃酮再現性試驗    29
| 伍、結果與討論    30
| 一、菟絲子全草基原鑑定之結果    30
| 二、菟絲子屬植物乙醇萃取物在抗人類肝癌細胞株
| (HepG2、Huh7)  增殖之結果    31
| 三、氧化氮生成量與細胞存活率分析    35
| 四、以 RP-HPLC 分析金絲桃苷之結果    36
| 五、總黃酮含量測定之結果    36
| 陸、結論    38
| 柒、參考文獻    39
| 捌、附錄    98
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| 表目錄
|
| 表 1.    菟絲子樣品編號、物種名及其採集地資料      48
| 表 2.    核糖體內轉錄區間 (Internal transcribed spacer, ITS) 片段
| 複製擴增專用引子組      51
| 表 3.    總黃酮含量測定之穩定性測試      52
| 表 4.    總黃酮含量測定之精密度測試      53
| 表 5.    總黃酮含量測定之再現性測試      54
| 表 6.    不同寄主之菟絲子屬植物萃取物的總黃酮含量對細胞毒性    與抑制發炎反應的影響      55
|
| 圖目錄
|
| 圖1.    菟絲子植物染色體 DNA 之 0.8% 洋菜糖膠電泳分析    58
| 圖2.    引子對 X12/A25-1 之PCR 產物洋菜糖膠電泳圖      59
| 圖3.    24 個菟絲子的ITS序列比對      60
| 圖4.    不同地區及寄主來源之菟絲子植物核糖體轉錄外區間
| (Internal transcribed spacer, ITS) 之 DNA 序列與
| 美國技術中心 (NCBI) 資料庫比對之親緣關係樹狀圖        65
| 圖5.    20 個平原菟絲子樣本的親緣關係樹狀圖    66
| 圖6.    倒立式顯微鏡下的人類肝癌細胞形態特徵      67
| 圖7. 不同寄主菟絲子屬植物乙醇萃取物對人類肝癌細胞株
| HepG2 與 Huh7 細胞存活率之影響      68
| 圖8.    6種不同寄主菟絲子屬植物乙醇萃取物對人類肝癌細胞株 HepG2 存活率的影響      69
| 圖9.    6種不同不同寄主菟絲子屬植物乙醇萃取物與人類肝癌
| 細胞株 Huh7 存活率的影響      70
| 圖10. 不同濃度速溶艾黴素注射劑 (Doxorubicin) 與蕾莎瓦
| (Sorafenib) 對人類肝癌細胞株 HepG2 存活率的影響      71
| 圖11. 不同濃度速溶艾黴素注射劑 (Doxorubicin) 與蕾莎瓦
| (Sorafenib) 對人類肝癌細胞株 huh7 存活率的影響      72
| 圖12. 寄生於雞屎藤 (Paederia foetida) 之菟絲子屬植物
| 乙醇萃取物劑量對 HepG2 細胞存活率之影響      73
| 圖13. 寄生於大花咸豐草 (Bidens pilosa var. radiata) 之菟絲子屬
| 植物乙醇萃取物劑量對HepG2 細胞存活率之影響      74
| 圖14. 寄生於南美蟛蜞菊 (Wedelia trilobata) 之菟絲子屬植物
| 乙醇萃取物劑量對HepG2 細胞存活率之影響      75
| 圖15. 寄生於金露花 (Duranta repens) 之菟絲子屬植物
| 乙醇萃取物劑量對HepG2 細胞存活率之影響      76
| 圖16. 寄生於雞屎藤 (Paederia foetida) 之菟絲子屬植物
| 乙醇萃取物劑量對Huh7細胞存活率之影響      77
| 圖17. 寄生於大花咸豐草 (Bidens pilosa var. radiata) 之菟絲子屬
| 植物乙醇萃取物劑量對 Huh7 細胞存活率之影響    78
| 圖18. 寄生於南美蟛蜞菊 (Wedelia trilobata) 之菟絲子屬植物
| 乙醇萃取物劑量對Huh7 細胞存活率之影響      79
| 圖19. 寄生於金露花 (Duranta repens) 之菟絲子屬植物
| 乙醇萃取物劑量對Huh7 細胞存活率之影響      80
| 圖20. 菟絲子屬植物乙醇萃取物 (寄生於雞屎藤)
| 以不同劑量處理48小時後之 HepG2細胞形態      81
| 圖21. 菟絲子屬植物乙醇萃取物 (寄生於雞屎藤)
| 以不同劑量處理48小時後之 Huh7 細胞形態      82
| 圖22. 菟絲子屬植物乙醇萃取物 (寄生於大花咸豐草)
| 以不同劑量處理48小時後之 HepG2細胞形態      83
| 圖23. 菟絲子屬植物乙醇萃取物 (寄生於大花咸豐草)
| 以不同劑量處理48小時後之 Huh7 細胞形態      84
| 圖24. 菟絲子屬植物乙醇萃取物 (寄生於南美蟛蜞菊)
| 以不同劑量處理48小時後之 HepG2細胞形態      85
| 圖25. 菟絲子屬植物乙醇萃取物 (寄生於南美蟛蜞菊)
| 以不同劑量處理48小時後之 Huh7 細胞形態      86
| 圖26. 菟絲子屬植物乙醇萃取物 (寄生於金露花)
| 以不同劑量處理48小時後之 HepG2細胞形態      87
| 圖27. 菟絲子屬植物乙醇萃取物 (寄生於金露花)
| 以不同劑量處理48小時後之 Huh7 細胞形態      88
| 圖28. 倒立式顯微鏡下的小鼠巨噬細胞 RAW264.7 形態特徵      89
| 圖29. 菟絲子屬植物乙醇萃取物對脂多糖 (LPS) 刺激
| 小鼠巨噬細胞 RAW264.7發炎反應之亞硝酸鹽
| 生成量比較      90
| 圖30. 菟絲子樣品對 LPS 誘導小鼠巨噬細胞 RAW264.7
| 之細胞存活率影響      91
| 圖31. 不同寄主菟絲子屬植物乙醇萃取物的 HPLC圖譜      92
| 圖32. 芸香素的標準曲線      93
| 圖33. 不同寄主之菟絲子屬植物甲醇萃取物的總黃酮含量
| 對 HepG2 細胞之毒性影響。      94
| 圖34. 不同寄主之菟絲子屬植物甲醇萃取物的總黃酮含量
| 對 Huh7 細胞之毒性影響      95
| 圖35. 不同寄主之菟絲子屬植物甲醇萃取物的總黃酮含量
| 對 RAW264.7 細胞之毒性影響      96
| 圖36. 不同寄主之菟絲子屬植物甲醇萃取物的總黃酮含量
| 對抑制發炎反應的影響      97
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| 附錄目錄
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| 附錄1. 菟絲子屬植物型態    98
| 附錄2. 脂多糖 (Lipopolysaccharide, LPS) 結構式示意圖    99
| 附錄3.    LPS所引發發炎反應的示意圖    100
| 附錄4.    98年男女性十大死因比較    101
| 附錄5.    98年男女性十大癌症死因比較    102
| 附錄6. 核糖體 DNA 內轉錄間隔區及引子設計位置區塊圖    103
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2011 年 9 月 22 日 20:01